رنگ آمیزی کپسول باکتری

مقدمه

بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی رامی پوشانداین لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی داردو همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .

کاربرد کپسول در باکتریها :

کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.

در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.

در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.

در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.

رنگ آمیزی کپسول : هدف از انجام این رنگ آمیزی، رنگ کردن کپسول باکتریایی است، بدین منظور برای مشاهده کپسول باکتریایی و رنگ آمیزی آن از یک باکتری دارای کپسول و یک باکتری فاقدکپسول استفاده می شود. کلبسیلانمونیا یک باکتری غیرمتحرک و کپسول دار با طول ۶-۶/٠ میکرومتر و به صورتهای تکی، جفتی و یا زنجیره های کوتاه مشاهده می شود. سلولهای این باکتری ها حاوی تمایز زیادی کپسول پلی ساکاریدی هستند و همین امر سبب ایجاد کلونی های موکوئیدی بزرگ از این باکتری ها می شود. بیش از ٨٠ آنتی ژن کپسولی در کلبسیلا یافت نشده است که در تعیین نوع مروتایپهای آن بسیار مفید است. کلبسیلا در ضایعات انسانی، نمونه های کلینیکی، آب، حبوبات وغلات، میوه ها و همچنین سبزیجات یافت می شوند. باکتری آلکالی ژنس دنتری نیکانس که توانائی احیای و را دارد . بسیاری از باکتریها مثل باسیلوس آنتراسیس «عامل سیاه زخم»، استرپتوکوکوس موتانس «عامل پوسیدگی دندان»، استرپتوکوکوس نمونیا «عامل ذات الریه» و قارچ کریپتوکوکوس نئوفرمانس «عامل کریپتوکوکوزیس» بوسیله یک لایه ژلاتینی محاصره و پوشیده شده اند که این لایه کپسول نامیده می شود. در آزمایشگاه های تشخیص طبی نشاندن وجود و حضور کپسول به منظور شناساسیی و تشخیص میکروارگانیسم بیماری زا و همچنین تعیین میزان و شدت بیماری حاصله از آن صورت می گیرد . برخی خصوصیات ساختاری کپسول مثل ضخامت کپسول در بین سویه های یک گونه باکتریایی کاملاً متفاوت است. ترکیباتی مانند پلی ساکاریدها، پلی پپتیدها و گلیکوپروتئین ها در ساختار تمام کپسول ها یافت می شوند. در اکثر موارد یک باکتری بیماری زا با ضخامت کپسول زیاد «کپسول ضخیم» نسبت به همان نوع باکتری فاقدکپسول و یا کپسول نازکتر از قدرت تهاجمی و بیماری زائی بیشتری برخوردار است، بنابراین کپسول از باکتری در برابر فعالیتهای فاگوسیتوزی سلولهای فاگوسیت بدن میزبان حفاظت می کند. حضور کپسول در اکثر اوقات بوسیله روشهای رنگ آمیزی از قبیل رنگ آمیزی منفی و جوهر هندی مشخص می گردد. ناحیه بی رنگ اطراف سلول باکتری احتمالاً مربوط به جدا شدن سلول از رنگ های احاطه کننده اطراف سلول در حین مرحله خشک کردن است. در روش برای شناسایی وجود و حضور کپسول ها عبارتند از : ١. روش رنگ آمیزی آنتونی «آنتونی جی آر باکتری شناس دانشگاه تگزاس در ایالت آستین در سالهای ١٩٣٠ بوده است» . ٢. روش رنگ آمیزی گراهام و ایوان در روش آنتونی از دو رنگ استفاده می شود، یکی رنگ اولیه و ابتدائی که کریستال ویولت است که محتویات باکتری و کپسولش صورتی تیره می شوند. برخلاف سلول کپسول غیریونی است و بنابراین رنگ به خود نمی گیرد. در این روش از سولفات مس به عنوان عامل رنگ برنده استفاده می شود. این ترکیب اضافه رنگ اولیه را از کپسول خارج می کند. در همین زمان سولفات مس بعنوان یک رنگ زمینه ای عمل می کند و به درون کپسول وارد شده و آن را به رنگ آبی کم رنگ یا صورتی در می آورد. در این فرآیند نمونه نبایستی بوسیله حرارت تثبیت شود زیرا این انقباض به صورت خودبخودی رخ می دهد ویک ناحیه شفاف را در اطراف باکتری بوجود می آورد که به اشتباه به جای کپسول در نظر گرفته می شود . رنگ آمیزی به روش آنتونی : در گوشه سمت چپ لام نام باکتری مورد نظر را که برای رنگ آمیزی آنتونی قرار است به کار ببریم می نویسیم. یک لوپ کامل از محیط کشت را برداشته و بروی اسلاید و لام قرار می دهیم و اجازه می دهیم که در دمای اتاق کاملاً خشک شود. لام را بروی راک رنگ آمیزی قرار داده و به مدت ٧-۴ دقیقه با کریستال ویولت رنگ آمیزی کرده، سپس بعد از رنگ آمیزی با سولفات مس لام را شستشو می دهیم. در مرحله بعد با کاغذ صافی لام را خشک می کنیم. در این مرحله با افزودن روغن ایمرسیون در زیر میکروسکوپ مشاهده می کنیم که کپسول یک هاله را در اطراف سلول تیره باکتری تشکیل داده است . روش تغییریافته رنگ آمیزی کپسول ( روش گراهام و ایوانس ) : با استفاده از الکل و پارچه تمیز لامی را که قرار است مورد استفاده قرار گیرد تمیز می کنیم. به میزان دو لوپ از محیط کشت را با مقدار ٢-١ قطره از جوهر هندی در یک انتهای لام با هم مخلوط می کنیم، سپس این ترکیب مخلوط به آرامی و آهستگی به سمت دیگر لام پخش و گسترده می نماییم تا یک لایه نازک تشکیل شود. نمونه را خشک می کنیم، بهتر است در هوای اتاق خشک شود. با استفاده از آب مقطر لام را شستشو داده اما باید مراقب بود که باکتریها روی لام پاک نشوند. به مدت یک دقیقه به آن کریستال ویولت اضاف می نماییم. دوباره با آب شستشو می دهیم ، سپس برای مدت زمان سی ثانیه با سافرانین رنگ آمیزی می کنیم. دوباره با آب شستشو داده و آنرا خشک می کنیم. چنان چه کپسول وجود داشته باشد باکتریهای صورتی تا قرمزرنگ در یک هاله شفاف قرار دارند و رنگ زمینه هم تیره و سیاه می شود .

روش کار در رنگ آمیزی کپسول :

۱- روی یک لام تمیز بمقدار مساوی از مرکب چینی و سرم فیزیولوژی را با هم مخلوط کرده و با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری را به آن اضافه کنید ، سوسپانسیون را به آرامی و کاملا مخلوط کنید و گسترش را پخش کنید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود.

۱- سطح گسترش را با آبی متیلن لوفلر بپوشانید و بگذارید ۳ دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و بعد با آب مقطر آنرا شستشو دهید. در این هنگام ممکن است مقداری از گسترش نیز شسته شود و این جای نگرانی ندارد چون گسترش ضخیم است و حتما مقداری از آن برای مطالعه شما باقی می ماند.

۲- لام را با زاویه ۴۵ درجه نگدارید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود . توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ خشک کن را روی آن نکشید.

اگر محیط مایع بود استفاده از سرم فیزیولوژی ضروری نیست .

هنگام مخلوط کردن کشت با مایع به آرامی هم بزنید تا آرایش باکتریها بهم نخورد.

طرز تهیه رنگها و محلولها :

۱- آبی متیلن لوفلر

- آبی متیلن ۳/.گرم

- اتانول۹۵% ۳۰سی سی

- آب مقطر ۱۰۰سی سی

رنگ را در اتانول حل کنید . آب مقطر را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را با استفاده از قیف از کاغذ صافی عبور دهید.

۲- سرم فیزیولوژی

- کلرور سدیم ۸۵/.گرم

- آب مقطر ۱۰۰سی سی